寡核苷酸是合成的短链DNA或RNA分子，可用于治疗，通过与目标基因或蛋白序列结合来阻碍基因表达或蛋白发挥作用。快速增长的寡核苷酸疗法市场包括靶向性非常强的反义DNA和小干扰RNA (siRNA)，在治疗癌症、遗传病和其他疾病方面有着广泛的应用前景。
液相色谱技术具有分离效率高、选择性好、检测灵敏度高、应用范围广等特点，已成为核酸药物生产与质控分析必不可少的重要手段。本期内容将介绍TSKgel色谱柱在寡核苷酸分析中的应用。
治疗性寡核苷酸分离色谱模式如下图：
一、离子交换色谱柱
TSKgel DNA-NPR阴离子交换色谱柱性能参数。
基质 | 聚甲基丙烯酸酯 |
粒径 | 2.5μm |
孔径 | 无孔 |
官能团 | 独有 |
抗衡离子 | ClO4- |
pH耐受范围 | 2.0-12.0 |
蛋白容量 | 5g BSA/L |
离子交换容量 | 0.1eq/L |
pKa | 11.2 |
下图是TSKgel DNA-NPR阴离子交换色谱柱对13个碱基的硫代磷酸寡核苷酸粗样分析的色谱图。
色谱条件：
色谱柱：TSKgel DNA-NPR（4.6×75mm）
流动相：A：20mmol/L NaOH（pH 12）+10mmol/L NaBr+1%二乙胺
B：20mmol/L NaOH（pH 12）+1mol/L NaBr+1%二乙胺
梯度：3.5min（20%B），12min（20%B），45min（55%B）
流速：1.0ml/min
检测：UV260nm
温度：60℃
样品：粗合成寡核苷酸（13mer，脱保护）
一、尺寸排阻色谱柱
硅胶基质填料表面键合二醇基，粒径2µm，适用于小分子蛋白、多肽、寡核苷酸等生物分子的快速、高分辨率分析。可兼容UHPLC系统与常规HPLC系统。
基质 | 硅胶 |
官能团 | 二醇基 |
粒径 | 2μm |
孔径 | 12.5nm |
分子量排阻限 | 500 kDa |
分离范围 | 5-100 kDa |
在寡核苷酸的分析中，尺寸排阻分离模式是基于碱基数量、磷酸基不同导致的分子量差别进行分离，通常用于简单的质量控制或纯度研究。
下图是采用两根串联的SEC色谱柱TSKgel UP-SW2000来区分长度相差一个碱基的寡核苷酸混合物 (20-mer和N-1 19-mer)。
色谱条件：
色谱柱：TSKgel UP-SW2000（2μm，4.6×300mm×2）
流动相：50mmol/L 磷酸盐缓冲液（pH 6.7）
300mmol/L NaCl，0.03% NaN3
流速：0.2 ml/min
检测：UV260nm
样品：19-mer and 20-mer
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