多糖的应用现状

近 20 年来,随着天然药物化学、药理研究的不断深入即分析手段突飞猛进的发展,多糖的研究引起了国内外许多学者极大的兴趣。研究表明, 多糖具有复杂的多方面的生物活性和功能,特别是对机体免疫功能的作用。现在多糖已成为天然药物及保健品研发中的重要组成部分。

作为药物的多糖在治疗肿瘤时,不像一般化疗药物直接杀死生长着的肿瘤细胞,而是促进细胞和体液免疫反应,如激活补体、巨噬细胞、T 淋巴细胞、B 淋巴细胞或加强抗体生成等,以达到抑制和消灭肿瘤细胞的作用,对正常细胞影响很小。

例如：紫草和枸杞多糖具有抗突变、抗衰老和增强免疫功能的作用;枸杞多糖等可抵抗自由基过氧化；香菇、商陆、松果、柴胡和云芝多糖可激活巨噬细胞,从而抑制肿瘤生长;

从三七、防风、甘草和刺五加中提取的多糖类化合物能激活网状内皮系统,发挥抗肿瘤作用;

灵芝多糖通过活化巨噬细胞和蛋白激酶 C (PKC)而发挥免疫增强作用等。目前,已有部分天然多糖类化合物用于临床,显示出良好的疗效,多糖在治疗肿瘤、代谢及感染性疾病等方面的应用仍在不断扩大,给近代肿瘤、艾滋病及其他疾病的治疗开辟了新的方向。

因此，许多学者也纷纷开始研究多糖，而多糖的分离纯化也成为了研究多糖不可或缺步骤。选择合适的分离纯化多糖填料尤为重要。

多糖的分离方法

尽管多糖来源不同、品种繁多，但其分离纯化的方法基本类似，主要是利用多糖溶于水或酸、碱、盐溶液，而不溶于醇、醚、丙酮等有机溶剂的特点。提取时，一般应先将植物原料脱脂和脱色素，然后以水为主体溶剂（如冷、热或稀的酸、碱溶液）提取多糖。提取液以醇、丙酮等沉淀析出，所获得的粗多糖需经反复溶解与醇析。对于含糖多的苷类也可采用此法得到总苷。 

糖类提取之后需要进一步除去大量的非糖杂质，再进行混合糖类的相互分离，这是一项比较困难的工作，尤其是多糖类难以获得纯品。一般可采用下列方法分离纯化混合多糖。其中柱层析法是目前采用比较多的方法。

部分沉淀法

金属盐沉淀法

提取液中加入中性醋酸铅可沉淀去除大部分酸性、酚性的杂质（如有机酸、氨基酸、蛋白质、树脂酸、黄酮、蒽醌、鞣质等），包括酸性多糖。而用碱式醋酸铅对多糖的沉淀就更为完全。

除去杂质后的母液用H2S脱盐后，单糖、低聚糖和水溶性较大的中性苷类仍保留在滤液中。

铅盐沉淀法除去杂质比较完全，母液脱铅后可用于单糖和低聚糖的定量，也可用铜盐沉淀法提取多糖。

季铵盐沉淀法

季铵类氢氧化物是一类乳化剂，可与酸性糖形成不溶性沉淀，常用于分离酸性多糖。季铵氢氧化物与中性多糖不生成沉淀，但当调高PH，使某些OH基解离，或加硼酸缓冲液增高糖的酸度，中性糖也能被沉淀。利用季铵氢氧化物在酸性、中性、微碱性、碱性中分级沉淀可以分离多糖。

甲醇分级沉淀法

常用的分级沉淀法是在混合多糖的浓水溶液中（常在PH=7时），逐步加入乙醇，收集不同醇浓度下析出的沉淀。一般各次沉淀需经反复溶解后，再醇析，直到测得的物理常数恒定，最常用的是旋光度测定和电泳检查。用分级沉淀法得到的多糖，常杂有较多的蛋白质，必须予以去除。一般选择那些使蛋白质沉淀而使多糖不沉淀的试剂来处理，如酚、三氯乙酸、鞣酸等。但必须处理时间短，温度低，避免多糖降解。

透析、超滤及超速离心

选用不同规格的超滤膜和透析带进行超滤和透析,以及一定条件下的超速离心操作,可按分子大小差异把多糖样品分级。超滤和透析更常用于除去小分子物质。 

制备性区域电泳

在电场作用下，不同的多糖按其分子大小、形状及其所带电荷的不同而达到分离。载体通常是玻璃粉。电泳完毕后，将玻璃粉载体推出柱外，分割后分别洗脱。此法分离效果较好，但只适于实验室小规模应用。常用的有聚丙烯酰胺凝胶电泳、醋酸纤维塑膜电泳。

柱层析法

凝胶过滤层析

它是根据多糖分子的大小和形状不同而达到分离的目的，已用于各种植物淀粉中直链和支链多糖的分离。常用的凝胶色谱分离材料主要有葡聚糖凝胶（sephadex G、sephadex LH-20）,琼脂糖凝胶（sepharose）,纤维素凝胶（cellufine GCL-2000）,聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel P）等。

在色谱分离时，大分子的多糖比小分子先洗下来。对于分子量较大的多糖，选择的sephadexG类对应的凝胶型号一般为sephadex G-100、sephadex G-150、sephadex G-200，这些都属于比较软的一些凝胶（其中sephadex G-200由于太软已经停止生产），这时，可以考虑用CellufineGCL-2000代替，此填料的基材为纤维素，机械强度好，且它的分子量范围较宽，比较适合多糖的分离。

离子交换层析

阴离子交换柱层析法是目前在多糖纯化中应用最普遍的一种方法,特别是对于体积较大的多糖溶液,大多数首先采用阴离子交换柱层析。通过柱层析,多糖溶液得到浓缩及初步纯化(有的多糖通过该步骤即可得到各种均一多糖组分)。至今应用的阴离子交换剂有DEAE-纤维素(DEAE-cellulose),DEAE-葡聚糖(DEAE-Sephadex)及DEAE-琼脂糖(DEAE-Sephadex) 3种,其中以DEAE-纤维素应用得最为广泛。DEAE-cellulose具有开放性的骨架,多糖能自由进入载体中并进行迅速扩散。

阴离子交换柱层析适合于分离各种酸性、中性多糖以及粘多糖。其分离机理不是单一的离子交换,而是吸附与解吸附,所以其不仅可应用于中性多糖与酸性多糖的分离,也可应用于不同中性多糖的分离。一般在pH值为6时,酸性多糖能吸附于AIER上,中性多糖不吸附,然后用pH值相同、离子强度不同的缓冲液将酸性多糖分别洗脱下来,但如果柱为碱性(即OH-型),则中性多糖也能吸附。另外,某些多糖还能与硼酸形成络合物,采用硼酸型AIER或硼酸溶液作流动相,从而使糖类物质能在AIER上进行分离纯化。如黄芪用水提取,经Pb (OAC)2沉淀除去蛋白质,加乙醇可使多种糖沉淀出来。粗多糖再溶于水,通过硼酸型DEAE-纤维素柱,以.01mol/L硼砂溶液洗脱,再用乙醇、丙酮处理,可得黄芪多糖成分AG-1。其他黄芪多糖成分如AH-1和AH-2等,也用同样的工艺进行分离纯化。吴亚林等通过DEAE-Sepharose fast flow阴离子交换层析得到纯化的无花果多糖。