第125期双柱层析（MCSGP）在治疗性寡核苷酸纯化的应用

2019年11月22日来源：管理员

本文讲述了如何将单柱层析转化为双柱层析（MCSGP）用于纯化治疗性寡核苷酸，从而显著提高产品的收率以及生产效率。

采用2根相同的层析柱，将第1根层析柱洗脱下的低纯度组分回收到第2根层析柱继续纯化，可同时保证纯度和收率。在本例中，单柱层析的收率仅为60%，而MCSGP在满足目标纯度要求前提下的收率则高达94%，显著优于单柱层析。MCSGP工艺开发，是通过Contichrom HPLC系统的MCSGP向导软件来实现的。

介绍

化学合成的寡核苷酸已广泛应用于DNA测序、聚合酶链反应（PCR）和分子克隆。寡核苷酸的未开发潜力在于其以靶向方式修饰基因表达的能力，从而为人类疾病带来新的、有效的治疗效果。经过几十年的发展，寡核苷酸已成为继小分子、多肽和蛋白质药物之后的主要开发药物之一，预计寡核苷酸药物将很快应用于以往无法治疗的遗传疾病上。鉴于寡核苷酸的合成成本较高，收率的增加将会对生产的经济性产生重大好处。

治疗性寡核苷酸的生产过程需要去除合成副产物，以使药物纯度符合要求，一般需采用层析方法进行精纯，但这通常会使收率降低40-60%。作为对策，可以将纯度较低的产品单独收集，并选择再次进行层析提纯，但这会明显降低生产效率，而且会增加分析检测的工作量。因此，迫切需要有更先进的层析手段来提高收率，并替代现有的层析方法。

MCSGP（Multi-column Counter-current Solvent Gradient Purification）可同时保证高纯度和高收率，有结果表明，与单柱层析相比，MCSGP可在满足目标纯度的前提下，使产品收率提高至90%。因此，MCSGP克服了单柱层析时收率和纯度无法兼得的问题，并且由于收率的提高，通常还可保证更高的生产效率和更低的溶剂消耗量。

MCSGP原理

图1. 传统单柱层析（左）：重叠组分被舍弃或暂时保留以再次进行层析。

MCSGP（右）：将重叠组分进行循环回收，不断去除杂质，收集纯产品。

与单柱层析不同，MCSGP是使用2根相同的层析柱进行连续层析（图1）。然而，两者的分离原则是基本一致的，即在层析过程中，都将样品分离得到3部分：纯产物、杂质和产物的重叠组分、仅含杂质的部分。收集纯产物部分，舍弃或重新处理含有杂质的重叠组分。如果将重叠组分舍弃，会使有价值的产物发生损失。对重叠组分进行再处理会积累杂质，因此适用性受到限制。此外，将重叠组分暂时保留并再次进行层析会降低整体生产效率。MCSGP通过内部回收（recycle）重叠组分，反复分离杂质和纯产物，从而同时保证纯度和收率。组分的回收过程是自动完成的，不需要进行离线分析。重叠组分从一个层析柱转移到另一个层析柱，并在每个cycle中会有新的样品再次上柱。这样可以确保连续操作，并在不影响纯度的情况下获得高收率的产品。

材料和方法

在30%氨水中制备治疗性寡核苷酸，最终浓度为45 g/L，并通过反相HPLC测得纯度为73.8%（图2）。

图2. 上样样品反相层析分析图谱

反相层析方法：采用单柱层析和双柱MCSGP纯化寡核苷酸，两种模式均通过Contichrom HPLC 30层析系统进行操作，并记录280 nm处紫外吸收值。使用2个内径0.77 cm、柱床高度10 cm的Hiscreen Q Sepharose FF柱（柱体积为2×5 mL）。溶剂为25 mm NaOH（A相）和25 mm NaOH+2 M NaCl（B相）。对于单柱层析，每次上样量为每mg填料上样1 mL。产品洗脱采用在线性梯度从10%B到90%B进行24 CV（柱体积）。共进行3次单柱层析操作，1次作为性能基准（Benchmark），2次作为MCSGP设计的基础。

图3. ChromIQ软件Batch向导界面

单柱（Batch）方法是使用Batch向导创建的，如图3所示。表1为单柱层析参数。

表1. 单柱层析参数比较。方法名称中的数字（150&300）对应洗脱流速。

Benchmark使用20cm床高进行。运行MCSGP时，使用10cm床高的层析柱2根，以保证在recycle步骤中2柱串联时的总高度不超过20cm。因此，仅运行单个10 cm层析柱的步骤（洗脱、清洗、CIP、再生）可以在2倍至3倍的线性流速下进行，而不超过层析柱的压力限制。这将会转化为更高的生产效率。采用10cm层析柱进行单柱层析，洗脱流速为300cm/h（Batch Run 300），作为MCSGP设计的基础。分段收集，并采用HPLC对各分段组分进行分析检测，以生成准确的纯度曲线，从而快速实施MCSGP。

单柱层析结果

图4和图6为单柱层析图谱。使用反相HPLC测定各洗脱组分的纯度，并用超微量分光光度计测定各洗脱组分的浓度（图5和图7）。

图4. Benchmark：Contichrom系统单柱层析图谱（黑色：A280nm；蓝色：电导率）

图5. Benchmark：洗脱组分检测结果

图6. Batch Run 300（用于MCSGP设计）：Contichrom系统单柱层析图谱（黑色：A280nm；蓝色：电导率）

图7. Batch Run 300：洗脱组分检测结果

这两种单柱层析的详细过程参数比较见表5。在要求目标纯度>91%的情况下，与Benchmark的20cm床高相比，采用10cm床高可产生更高的生产效率，这是因为10cm床高可使用更高的线性流速。然而，Batch Run 300的收率会比Benchmark低5%，这是因为满足纯度要求的收集范围较窄。

MCSGP设计

可以单柱层析结果为基础，通过MCSGP向导生成双柱MCSGP方法（见图8）。Contichrom系统的ChromIQ软件可提供MCSGP向导功能。MCSGP采用与单柱层析相同的层析柱、溶液体系和相同的层析方案。

图8. MCSGP向导：以单柱层析图谱为基础，整个MCSGP设计过程可在15分钟内完成。

在STEP1中，需要将单柱层析图谱加载到MCSGP向导（图9）。在STEP2中，需要将检测得到的各洗脱组分纯度和浓度结果与单柱层析图谱进行叠加。

图9. MCSGP向导界面

在STEP3中，通过拖动不同颜色区域的边界，将层析图谱划分为纯产物（Product）、重叠组分（Recycle）以及杂质（Waste）（图9和图10）。可由系统软件模拟计算得到收集样品的纯度，并可根据区域划分的变化自动进行更新。

图10. MCSGP向导STEP3示意图，其中包括Recycle区域（A-B为蓝色，C-D为绿色）和Product区域（B-C为红色）

图9和图10突出显示了三个区域，分别为1个Product区域（红色）和2个Recycle区域（蓝色和绿色）。MCSGP过程具体如下：

A：产品洗脱出峰时开始进行回收（Recycle）；

B：产品纯度达到90%时开始收集目标物（Product）；

C：产品纯度低于90%时结束收集目标物，并再次开始回收（Recycle）；

D：产品洗脱完毕，结束回收。

在STEP4中，可设定层析柱规格及上样体积。MCSGP所使用的2根层析柱的规格型号、装填高度均与单柱层析时相同。MCSGP向导会根据红色区域与蓝色、绿色区域的面积比例，自动调整上样量，确保工艺稳定。

在STEP5中，输入与单柱层析相同的层析工艺参数，MCSGP向导会自动计算出稀释因子，从而保证回收组分被稀释后可与层析柱再次结合。

在STEP6中，MCSGP向导可以模拟计算出相关工艺参数并进行显示，包括产品纯度、生产效率、上样量、溶液消耗量以及收集样品的浓度，并可设定cycle次数。此外，MCSGP向导还可自动生成 start-up和shut-down方法。整个MCSGP设计过程可在15分钟内完成。

分别以150 cm/h、300 cm/h和450 cm/h的洗脱流速进行了3次MCSGP运行，以保证在层析柱耐压范围内进行工艺测试，见表2。

表2. MCSGP方法参数比较。方法名称中的数字（150、300和450）对应洗脱流速。

MCSGP操作

图11为MCSGP Run 150层析图谱，此为MCSGP的典型图谱。层析图谱显示了2根层析柱可交替进行洗脱操作。2根层析柱在每个cycle中各会完成一次洗脱。

ChromIQ软件还可以将连续过程（如MCSGP）的多个cycle进行叠加（图12）。叠加图谱表明从cycle2开始进入稳态。

图11. MCSGP Run 150层析图谱，共显示5个cycle

图12. MCSGP纯化寡核苷酸的叠加图谱，共5个cycle。该图显示出洗脱曲线的变化很小，洗脱峰也很相似。第1组洗脱产物来自柱2（蓝色曲线），第2组洗脱产物来自柱1（红色曲线）。

每个cycle会进行2次收集，每柱各1次。检测表明，每个cycle的产量、浓度、纯度均一致。图13为MCSGP的5个cycle分析图谱叠加。HPLC检测结果显示，三种不同洗脱流速的MCSGP产品纯度均高于91%的目标阈值，每次均运行5个cycle，见表4。

图13.寡核苷酸反相分析图谱，5个cycle的叠加显示出一致的产品质量。此图为MCSGP Run 150的结果，三种不同洗脱流速的MCSGP检测结果相似。

表3为MCSGP Run 300的5个cycle工艺参数与MCSGP向导模拟计算结果的对比。实测数据与模拟计算结果接近，说明可以在单柱层析结果的基础上，将MCSGP向导作为数据预测工具使用。

表3. MCSGP Run 300工艺参数与MCSGP向导模拟计算结果的对比

单柱层析与MCSGP工艺对比

从收率、纯度、生产效率、产品浓度和溶液消耗等方面对单柱层析和双柱MCSGP进行了计算和比较，MCSGP在各方面均表现出明显优势（表5）。

将采用20cm床高的Benchmark与采用10cm床高的单柱模式（Batch Run 150和Batch Run 300）进行了对比，与预测情况相同，较短层析柱的收率会明显低于较长的层析柱，这是因为较短的层析柱分辨率较低。然而，如果不考虑收率，就生产效率而言，较短的层析柱优势更明显，尤其是在使用较高流速时。与采用20cm床高的Benchmark相比，采用10cm床高的单柱模式（共2根层析柱，累计床高20 cm）收率会从60%降至55%，但生产效率会提高3倍。

MCSGP的主要优点是在目标纯度大于91%的前提下，与所有单柱模式相比，产品收率可显著提升。按照测试流速，在92%纯度要求前提下，MCSGP收率可比Benchmark单柱模式高出50-57%，详见表5、图12和图14。MCSGP收率也显著优于10cm床高的单柱模式。

在生产效率方面，MCSGP的优点是在洗脱时可运行比Benchmark更高的流速，这是因为柱床高度降低了一半，层析柱反压更低。这意味着，与Benchmark相比，MCSGP可使生产效率翻倍，而保证收率仍高于90%（图15）。将MCSGP直接与10cm床高的单柱模式进行比较，发现10cm床高的单柱模式生产效率更高。首先，与MCSGP相同，10cm床高的单柱模式支持采用更高的流速。其次，与MCSGP不同，10cm床高的单柱模式没有2柱串联的步骤，因此避免了采用较低流速的过程。最后，由于MCSGP的recycle功能，每cycle的新样品上样量都会受限，本例中，每cycle的新样品上样量约为单柱模式的50%。实际上，对于许多大规模的寡核苷酸生产来讲，收率增加5%比生产效率提高3倍更具有经济意义，这是因为寡核苷酸的合成成本很高（见表 5 Benchmark与Batch Run 300对比）。事实上，由于MCSGP在提高收率方面优势明显，预计提高收率部分所产生的价值将迅速抵消购买连续流设备的成本投入（见文献Müller-Späth, T., & Bavand, M. (2019). Purification of Synthetic Peptides by Countercurrent Chromatography (MCSGP)-Economic Evaluation. Pharmaceutical Engineering, 39(2), 68–77）。因此，应该把提高纯化收率作为本研究的主要目的。