多肽的分离纯化工艺举例（2-3步）

常用工艺

一、尺寸排阻色谱

* 利用色谱填料的细孔径、基于分析物尺寸大小达成分离的模式

* 优势

1. 色谱条件单纯，利于品质管理的使用

2. 根据分子量（尺寸）大小可以预判洗脱位置

* 缺点

1. 样品可进样量相对较小

2. 分析物可能会与固定相（色谱填料）发生疏水相互作用

* 流动相推荐

1. 流动相：0.1 % TFA＋ 45% 乙腈（0.1 % TFA非必须）

2. 同种流动相，含有蛋白组分时蛋白的空间构造被破坏，分子呈伸展状态（变性），

这时候进行分子量表征时，使用100 %水溶液条件下标准蛋白校正曲线不合适

3. 含0.1 % TFA的流动相分析疏水性高的多肽时，如果洗脱较迟，可以推荐使用醋酸溶液等

二、反相色谱

* 基于分析组分在两相间的分配差异而达成分离的模式

* 优势

1. 分辨率非常高

2. 适合联用MS检测

3. 精制纯化时，使用挥发性的盐可省时省力

4. 选择性、保留的差异丰富→ C18, C8, C4, CN, Phenyl, 碳含量・导入方式、细孔径、粒径

* 缺点

1. 样品处理量相对较小

2. 使用有机溶剂

3. 样品的保留、平衡、重复性→ 低（无）有机溶剂浓度或使用离子对试剂时，需进行充分的平衡

* 流动相推荐

有机溶剂（乙腈、甲醇）不同，分离选择性不同（40 %的乙腈与60 %的甲醇，保留能力基本相同）

杜邦树脂在多肽纯化中的应用

二、离子交换色谱

* 利用静电相互作用程度差异达成分析组分分离的模式

* 优势

1. 分辨率高

2. 样品处理量大（载量高，尤其适合纯化制备）

* 缺点

1. 由于使用盐进行洗脱，不适合MS联用检测

2. 分析物可能会与固定相（色谱填料）发生疏水相互作用

* 流动相推荐

1. 流动相：含有机溶剂的盐缓冲液，利用盐或pH的梯度洗脱

2. 阳离子交换色谱一般使用酸性溶液体系；阴离子交换色谱一般使用中性或弱碱性溶液体系

3. 对于疏水性高的多肽，要注意可能会发生洗脱相对迟缓的现象

东曹离子交换填料在胰岛素纯化中的应用

已做案例----抗菌肽