第一百一十期 Discovery整合化层析应用案例分享

2018年08月20日source：管理员

很多药企做细胞株筛选，或者抗体糖型的培养工艺调节，摇瓶培养的数量都是非常大的，需要进行一系列的平行实验、对比实验，等到样品收获时，给下游纯化人员所造成的纯化压力也是巨大的。经常听到有人抱怨：领导一直催着完成纯化，需要送检看结果，可是再催，纯化步骤也还得一步一步来，那么多样品，怎么可能在短时间内完成所有纯化？

其实，已有设备生产企业意识到了这一点，而且已经研发出整合化层析技术来应对这一难题。整合化层析，即将多步层析整合为一步，从而缩短纯化时间，提高纯化效率，这种技术是否真能起到作用呢？今天，小编就与各位分享一下该技术的应用案例，跟大家一探究竟。

1）Protein A - Desalting

第一步：Protein A，1 mL预装柱

第二步：Desalting（分子筛脱盐换液），10 mL预装柱

方法信息
纯化步骤	Protein A - Desalting
第一步 – Protein A
Buffer A – 平衡液	25 mM PB, 150mM NaCl, pH 7.4
Buffer B – 洗脱液	100mM citrate, pH 3.5
Buffer C – NaOH	0.1 M NaOH
样品上清液	10 mL CHO单抗上清液，浓度1.0 mg/mL
第二步– Desalting
Buffer D – 平衡液	25 mM PB, pH 7.4

层析过程图谱：

在该过程中，Protein A的洗脱组分不经过收集，而是在系统内直接上样至脱盐柱，两步层析整合为一步，从而提高了纯化效率。

最终产品经SE-HPLC检测，单体纯度为96.5%，可直接用于其它常规检测

结果汇总
产品浓度	3.7 mg/mL
产量	9.92 mg
单体含量	96.5%
聚集体含量	3.2%

2）IMAC - Desalting

第一步：IMAC，1 mL预装柱Chelate (Cu²⁺)

第二步：Desalting（分子筛脱盐换液），10 mL预装柱

方法信息
纯化步骤	IMAC - Desalting
第一步 – IMAC
Buffer A – 平衡液	25 mM PB, 0.5 M NaCl, 10 mM imidazole, pH 7.5
Buffer B – 洗脱液	25 mM PB, 0.5 M NaCl, 0.5 M imidazole, pH 7.5
Buffer C – NaOH	0.1 M NaOH
样品上清液	5 mL E. coli BL21(DE3)细胞裂解液，过量表达20 kDa His6-UCB9 (浓度0.5mg/mL)
第二步– Desalting
Buffer D – 平衡液	1x PBS, pH 7.4

层析过程图谱：

在该过程中，IMAC的洗脱组分同样直接上样至脱盐柱，节省了纯化时间。

最终产品经SDS-PAGE及SE-HPLC检测，单体纯度为98.1%，可直接用于其它常规检测。

结果汇总
产品浓度	1.1 mg/mL
产量	2.3 mg
单体含量	98.1%
聚集体含量	1.9%

3）Protein A - CIEX - Desalting

第一步：Protein A，1 mL预装柱

第二步：CIEX，5 mL预装柱（SP）

第三步：Desalting（分子筛脱盐换液），10 mL预装柱

方法信息
纯化步骤	Protein A - CIEX - Desalting
第一步 – Protein A
Buffer A – 平衡液	25 mM PB, 150mM NaCl, pH 7.0
Buffer B – 洗脱液	100mM citrate, pH 3.5
Buffer C – NaOH	0.1 M NaOH
样品上清液	10 mL CHO单抗上清液，浓度1.0 mg/mL
第二步 – CIEX
Buffer D– 平衡液	25 mM PB, pH 6.0
Buffer E – 洗脱液	25 mM PB, 0.5 M NaCl, pH 6.0
Buffer C – NaOH	0.1 M NaOH
第三步 – Desalting
Buffer F – 平衡液	25 mM PB, pH 7.0

层析过程图谱：

在该过程中，Protein A的洗脱组分经过在线稀释，直接上样至CIEX层析柱，CIEX进行线性洗脱，去除降解物及聚集体，将目标组分直接上样至脱盐柱。三步层析紧密衔接，前一步层析的洗脱与后一步层析的上样同时进行，使得纯化效率显著提高。

最终产品经SE-HPLC检测，纯度高达99.5%，二聚体含量仅为0.5%，比Protein A - Desalting两步层析所得产品的二聚体含量降低近6倍，该产品可直接用于氨基酸序列测定、二硫键测定以及糖型分析等高纯度要求的检测。

结果汇总
产品浓度	0.91 mg/mL
产量	6.7 mg
单体含量	99.5%
聚集体含量	0.5%

4）高通量（HT）纯化应用

将Discovery系统额外扩展出35个入口用于上样，即实现整合化层析的高通量纯化应用。通过Discovery Wizard，可将每个入口的上样体积、流速等信息预先设定，即可实现高通量自动化操作。
采用Protein A - CIEX - Desalting三步向导模块，每次上样10 mL单抗上清液（1.0 mg/mL），每次产量均≥6.5 mg。单个样品的纯化耗时约为74 min，在24 h内纯化出多达19个样品！而且该时间包含了层析柱的清洗环节。该系统持续运行5天，纯化样品总数量高达91个。

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